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Corso di Introduzione alla immunologia Suina

COME SI STUDIANO LE IMMUNOGLOBULINE?

Le immunoglobuline si trovano in due forme diverse: facenti parte del recettore BcR dei linfociti B o come anticorpi nel siero, nei fluidi corporei e tissutali. Il loro studio rappresenta un arma fondamentale per la Sanità Animale.



IMMUNOGLOBULINE DI SUPERFICIE

Come abbiamo visto nel capitolo 2 Come si studiano i linfociti B?, esistono diversi metodi per studiare le immunoglobuline di membrana dei linfociti B che costituiscono il recettore BcR. I due più utilizzati sono:

  • Lo studio mediante coniugati monoclonali o policlonali dei diversi isotipi di immunoglobuline, marcati con isocianato di fluorescina ed osservati al microscopio a fluorescenza.

  • Le analisi mediante citometria di flusso, utilizzando anticorpi monoclonali di ogni isotipo di immunoglobulina. 

Schema di funzionamento del citometro di flusso

Schema di funzionamento del citometro di flusso per il rilevamento di immunoglobuline di superficie nei linfociti B. Le cellule in sospensione, alle quali è stato aggiunto i diversi AcM (anti IgA e IgG) che passano attraverso un tubo molto fine in una sola fila di cellule, e sono lette dal laser e dal fascio di luce; il primo identifica gli anticorpi marcati ed il secondo, la dimensione delle cellule.  

Agglutinamento in provetta

Immagine di un agglutinamento in provetta

Le immunoglobuline libere nel siero, colostro, latte, fluidi, etc. possono essere studiate come immunoglobuline totali, senza considerare verso quale antigene reagiscano, o come anticorpi specifici verso diversi antigeni d'interesse. Per quest'ultimo tipo di studio, che senza dubbio è quello più interessante, si dispone di un gran numero di tecniche che vanno da quelle classiche di precipitazione, fissazione del complemento, etc; alle più moderne e più utilizzate tecniche immunoenzimatiche.

Le differenze di sensibilità, specificità, capacità di utilizzo su larga scala, ecc. sono alcuni degli elementi da tenere in considerazione al momento di scegliere il tipo di tecnica. Per quanto riguarda la sensibilità, possiamo osservare che ci sono tecniche con bassi livelli, come ad esempio la precipitazione, tecniche di sensibilità media come quelle dell'agglutinazione batterica, fissazione del complemento ed altre con sensibilità maggiore come ad esempio ELISA, sieroneutralizzazione o attività battericida.

Lo sviluppo della biologia molecolare e la produzione di anticorpi monoclonali, ha permesso, negli utlimi anni, di disporre di reagenti di diagnostica di grande sensibilità e specificità, anche in forma di KITS, di facile utilizzazione ed interpretazione.

Tra tutti i metodi attualmente disponibili, in questo capitolo parleremo, prima di quelli che garantiscono le maggiori possibilità di realizzare studi sierologici su larga scala e che possono essere applicati senza necessità di grandi mezzi tecnici. 

Sensibilità delle differenze tecniche per il rilevamento di anticorpi (mg/ml)

METODO 

SENSIBILITA' (mg/ml)

Precipitazione in gel 

30

Diffusione radiale

18

Agglutinazione batterica 

0,05

Fissazione di complemento 

0,05

emagglutinazione passiva 

0,01

Inibizione dell'emagglutinazione 

0,005

Immunofluorescenza 

0,005

ELISA 

0,0005
Neutralizzazione batterica  0,00005

Poi, rivedremo altri metodi che permettono di studiare un numero ridotto di campioni, ma che presentano buoni indici di sensibilità, specificità e che non richiedono grande equipaggiamento. Per ultimo, data la sua importanza, vedremo una tecnica di riferimento per tutti gli studi sierologici, che necessita di maggiori infrastrutture e tempi di realizzazione. 

I principali metodi che hanno queste caratteristiche sono:

  • ELISA 

ire

  • IMMUNOELETTROTRASFERENZA O WESTERBLOT
ire
  • IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA O IMMUNOPEROSSIDASI
ire
  • SIERONEUTRALIZZAZIONE
ire


ELISA

La tecnica immunoenzimatica ELISA forma parte di quelle reazioni sierologiche che utilizzano coniugati per poter visualizzare la reazione ANTIGENE-ANTICORPO. Il test ELISA, si basa sull'utilizzo di anticorpi marcati con un enzima (generalmente la perossidassi), in modo che i coniugati risultanti abbiano una attività sia immunologica sia enzimatica. Avendo uno dei componenti (antigene o anticorpo) adeso alla piastra la reazione antigene-anticorpo è immobilizzata e pertanto potrà facilmente essere evidenziata con l'addizione del substrato, che reagendo con l'enzima produrrà una colorazione osservabile a vista o quantificabile con un colorimetro.  

Esistono diversi KITS commerciali disponibili e quindi si possono realizzare studi sierologici senza necessità di grandi mezzi.


KITS commerciali





Attualmente il test ELISA è uno dei metodi più utilizzati per la diagnosi sierologica di diverse malattie infettive suine.


Il metodo ELISA è consigliato, fondamentalmente, per lo studio di popolazioni. E' una tecnica altamente sensibile e di grande specificità, che permette di realizzare in un breve spazio di tempo studi sulle grandi popolazioni, in modo semplice ed economico.  Questa tecnica presenta, inoltre, una buona riproducibilità e facilità nell'interpretazione dei risultati. 

Elisa

Nella prima linea si osserva il siero controllo positivo e nella seconda il negativo. I sieri campione in doppio sono stati collocati nel resto della piastra, si osservano positivi (blu) e negativi (incolore).

Esistono diversi modelli di tecniche ELISA per la determinazione sia di ANTIGENI sia di ANTICORPI:

DETERMINAZIONE DI ANTIGENI

La modalità più frequente del metodo ELISA per la determinazione di antigeni è il modello ELISA "Sandwich". In questo modo, la piastra è già predisposta con un anticorpo fissato (monoclonale o policlonale) verso l'antigene campione, al quale si aggiungerà un omogenato dell'organo sospetto, che in caso di reazione con l'anticorpo della piastra, sarà messo in evidenza dopo l'aggiunta del secondo anticorpo marcato con l'enzima. Per ultimo, si aggiunge il substrato per rilevare la reazione.


Elisa "Sandwich" diretto

Fasi della tecnica Elisa Sandwich. (1) Un anticorpo monoclonale o policlonale anti antigene viene solitamente insieme alla piastra. (2) si  incuba con il campione da analizzare.(3) si aggiunge il coniugato. (4) per ultimo il  substrato. Tutti i passi sono preceduti da incubazioni e lavaggi. 

DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

Per la determinazione di anticorpi specifici verso un determinato antigene, si utilizzano normalmente le seguenti modalità:

  • ELISA INDIRETTO. 

  • ELISA COMPETIZIONE.



Elisa indiretto

Fasi della tecnica Elisa indiretta. (1) L'antigene si "incolla" alla piastra (2) Si aggiunge il siero campione. (3) poi, il coniugato. (4) per ultimo, il substrato.

ELISA INDIRETTO

E' il metodo più utilizzato per la determinazione di anticorpi. Consiste nel fare aderire alla piastra ELISA l'antigene (nei Kits viene già fissato) dal quale vogliamo sapere se nel siero campione esistono anticorpi specifici. Si possono utilizzare come antigeni, proteine virali o batteriche ed anche virus batterici.

E' sempre più frequente l'utilizzo delle proteine di interesse immunologico e non di tutte le proteine antigeniche. I passi successivi sono l'aggiunta del siero campione, l'incubazione e lavaggio, ed in fine l'aggiunta del substrato, che reagisce con l'enzima e poi si passa alla lettura.

ELISA  PER COMPETIZIONE

Questo sistema è molto utilizzato per il rilevamento di anticorpi specifici. Si parte da un anticorpo (monoclonale o policlonale), verso un antigene conosciuto, che previamente è stato immobilizzato nella piastra. Viene chiamato di competizione perché il siero campione è incubato previamente con l'antigene, prima di incubarlo con l'antisiero fissato nella piastra, e quindi è in competizione con quest'ultimo.

I passi successivi sono l'aggiunta e l'incubazione col coniugato, lavaggio, aggiunta finale del substrato e lettura.  


Tecnica Elisa di competizione


Fasi della Tecnica Elisa di competizione. (1) Si incuba il siero campione con l'antigene. (2) La miscela precedente si deposita sui pozzetti dove previamente è stato fissato un siero anti antigene (3) si aggiunge il coniugato. (4) dopo, il substrato. In questo caso l'assenza di colore indica positività.



Kit da immunotrasferenza

Materiale necessario per la realizzazione dell'immunotrasferenza: Strisce di nitrocellulosa antigenate, Tampone PBS, sieri di riferimento positivo e negativo, soluzione substrato e supporto plastico per realizzare tutti i processi.



IMMUNOELETTROTRANSFERENZA O WESTERBLOT

L'immunoelettrotransferenza "westerblot" o "Immunoblotting" è una tecnica immunoenzimatica che si utilizza per il rilevamento di anticorpi specifici. Si consiglia quando non occorra studiare un gran numero di sieri o per analizzare sieri risultati dubbi con altre tecniche. Questo metodo utilizza come supporto antigenico filtri di nitrocellulosa, dove le proteine dell'antigene sono state previamente trasferite, mantenendo in modo totale o parziale le loro proprietà antigeniche. 

Per l'ottenimento dei filtri antigenati, le proteine sono separate previamente mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) e trasferite in continuo, mediante corrente elettrica, al filtro di nitrocellulosa. Questo filtro è ritagliato in piccole strisce, che costituiranno il supporto antigenato. Su ciascuna di esse sarà incubato il siero campione ed i sieri controllo positivo e negativo. Dopo un periodo di incubazione e successivo lavaggio, si aggiunge un coniugato anti immunoglobulina G o M (dipende da quale si desidera studiare). Se ci sono immunoglobuline unite alle proteine antigeniche, saranno rilevate dal coniugato. Si potranno osservare una o diverse linee di precipitazione specifiche a seconda che esistano anticorpi verso una o diverse proteine. La specificità si dimostra facendo reagire proteine il cui peso molecolare coincida con le proteine antigeniche.

E' una tecnica molto sensibile, di facile utilizzo, esecuzione ed interpretazione. Non ha bisogno di apparecchiature speciali per la sua realizzazione. 

Questa tecnica è fondamentalmente indicata nello studio di un numero non molto elevato di sieri. Non avendo bisogno di nessun tipo di apparecchiatura speciale, risulta di facile realizzazione anche in piccoli laboratori. Attualmente esistono alcuni Kits disponibili, ma l'offerta andrà progressivamente aumentando.

Fase finale della tecnica

Fase finale della tecnica. Si possono osservare le diverse strisce con le quali reagisce il siero campione ed il siero controllo.



immunofluorescenza indiretta

Tecnica di immunofluorescenza indiretta. Cellule MS infette con il virus della Peste suina africana. Si può osservare come gli anticorpi si siano uniti alle cellule infette, creando nel citoplasma zone con una intensità maggiore, che corrispondono a zone di maggiore replica virale, e quindi maggiore fissazione di anticorpi.

LA IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA O IMMUNOPEROSSIDASI

L'immunofluorescenza indiretta o la immunoperossidasi, a seconda se si utilizza l'isocianato di fluoresceina o la perossidasi, sono tecniche che uniscono la specificità istologica (possono vedere la cellula e verificare che la reazione immunologica si produce in un luogo specifico) con la sensibilità delle tecniche immunologiche.

Queste tecniche utilizzano normalmente colture cellulari (primarie o di linea stabili) infettate con il virus o il batterio, verso il quale si desidera verificare se ci siano anticorpi nel siero campione. Dopo l'incubazione con il siero campione; se ci sono anticorpi si uniranno alle cellule infette, ma non a quelle non infette (specificità istologica osservabile). L'unione si visualizza dopo l'aggiunta di un coniugato anti-immunoglobulina, marcato con isocianato o con perossidasi, e la successiva osservazione rispettivamente al microscopio a fluorescenza o convenzionale .

SIERONEUTRALIZZAZIONE

Questo metodo è considerato il punto di riferimento per qualsiasi studio sierologico, dato che è quello che da più correlazione tra la risposta "in vitro" e la risposta "in vivo". In questo test si può valutare la capacità che hanno gli anticorpi presenti nel siero campione di neutralizzare l'attività biologica di un antigene. 

I metodi descritti fin'ora permettono di valutare la capacità che ha un determinato siero di riconoscere un antigene concreto, nella sieroneutralizzazione si avanza di un passo in più e si indica la capacità che possiede un siero di neutralizzare l'attività biologica dell'antigene. Questi metodi sono ampliamente utilizzati nei laboratori per valutare la capacità di un siero contro tossine batteriche, batteri e/o virus. Questi test sono più operosi, richiedono colture cellulari, sterilità, oltre ad essere in genere più lenti di tutti gli altri. Tuttavia, sono altamente specifiche e sensibili, e si considerano i test di riferimento per qualsiasi valutazione sierologica.

Coltura cellulare infettata

Piastra di una coltura cellulare infettata.

Nel caso dei virus, si può misurare la capacità di un determinato siero di neutralizzare il potenziale infettivo del virus sulla linea cellulare sensibile. Si aggiunge alle cellule una miscela di virus ad una concentrazione costante che è stata a contatto precedentemente con diverse diluzioni del siero campione . Si osservano le cellule sulle quali sono state aggiunte le diverse diluzioni, per vedere se sono state infettate dal virus o no, mediante la colorazione con un coniugato o con l'osservazione dell'effetto citopatico. In questo modo si può misurare la capacità di neutralizzazione virale di un siero campione.

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