COSA SONO I SIEROPROFILI?

I sieroprofili si basano sul rilevamento degli anticorpi circolanti tramite una fra le tecniche attualmente disponibili, con il fine di poter ottenere informazione sullo stato dell'animale in quel momento o in condizioni precedenti. Questi studi vengono utilizzati sempre di più per il controllo sanitario degli allevamenti di suini, rappresentando in molti casi un mezzo per ridurre i costi ed aumentare il livello sanitario. 

Le analisi sierologiche permettono, tra le altre possibilità: di conoscere la situazione sanitaria, di scegliere il miglior momento per vaccinare, di controllare i programmi di vaccinazione e di evitare l'ingresso di malattie in allevamento.

Per effettuare uno studio sierologico appropriato in un allevamento dobbiamo considerare, innanzi tutto, i seguenti punti:

Cosa desidero conoscere del mio allevamento?. Qual'è la domanda che voglio fare?. La sierologia può risolvere i miei dubbi?
Su quali animali e in che momento devo interrogarmi?.
Che numero di campioni devo testare e come devo effettuare il prelievo?.
Quali differenze ci sono fra le varie tecniche?

1. Cosa desidero conoscere del mio allevamento? 
   Questa è la prima domanda che dobbiamo farci prima di iniziare uno studio. Cosa desidero conoscere del mio allevamento?. Come vedremo più avanti, la sierologia ci può aiutare a conoscere alcune cose, ma non altre. E' importante conoscere questi limiti. La  dinamica con cui si producono gli anticorpi, la difficoltà nel differenziare gli anticorpi vaccinali da quelli che seguono l'infezione, il tempo che impiegano gli anticorpi ad apparire dopo un'infezione, ecc. sono alcune considerazioni che dobbiamo sempre tenere a mente prima di pianificare uno studio sierologico.

Voglio conoscere la presenza o l'assenza di una qualche malattia? Come procede il programma vaccinale? Qual'è lo stato sanitario degli animali da rimonta?, ecc. Queste sono alcune delle domande che si possono formulare e per le quali gli studi sierologici sono indicati. Nelle applicazioni della sierologia vedremo come potremo effettuare questi studi. 

2. Su quali animali e in che momento devo interrogarmi?.
   Questa è un'altra domanda importante che dobbiamo avere chiara. E' necessario ricordarsi che gli animali nelle diverse fasi di produzione possono presentare profili sierologici diversi; poi dobbiamo rivolgerci a quei gruppi di animali in grado di darci delle risposte. Come esempio, va tenuto presente che le immunoglobuline non attraversano la placenta, per cui i suinetti non possiedono immunoglobuline fin dopo l'assunzione del colostro materno. 

A partire dall'acquisizione del colostro si andrà acquisendo immunità umorale. Questa risposta umorale sarà il riflesso dell'immunità materna e non ancora di quella del suinetto. La massima produzione di colostro si ottiene fra le 6 e le 36 ore dopo il parto, anche se la presenza di immunoglobuline nel sangue rilevata fra le 12 e le 24 ore dopo l'ingestione del colostro, si mantiene nel circolo sanguigno per tempi molto variabili a seconda del tipo di immunoglubulina, della condizione immunologica della madre, del tipo di agente infettivo ecc...In generale si possono rilevare immunoglobuline colostrali tra le 3, 8 e 20 settimane di vita dell'animale. Per questo e per altri motivi è importante sapere, in relazione alla domanda che ci vogliamo fare, in quale età ed a quale gruppo di animali dobbiamo prelevare i campioni: scrofe, suinetti, grassi, ecc.

3. Quanti campioni sono necessari per uno studio sierologico?
   Questa è un'altra delle domande chiave affinché i risultati siano significativi della situazione. Inoltre, per prelevare campioni da settori differenti dell'allevamento e da diverse aree produttive, è allo stesso modo importante definire di quanti campioni avrò bisogno. Due aspetti che sono importanti al momento della valutazione di un allevamento di suini: per coloro che vogliono sapere se è presente o meno una certa malattia nell'allevamento e in caso affermativo quali studi ne rivelino la prevalenza. In altre parole le domande dovrebbero essere: Esiste tal o tal'altra malattia nel mio allevamento? In caso affermativo qual'è la sua prevalenza?. Per rispondere ad una o all'altra domanda è fondamentale stabilire il numero di campioni che vogliamo analizzare. Il numero di campioni dipenderà anche dal grado di precisione che desideriamo ottenere. Per questi studi esistono tabelle  (vedi altre fonti di informazione) che indicano il numero di campioni che dobbiamo analizzare in funzione della prevalenza stimata, della precisione e del livello di confidenza desiderato.  Il numero di campioni necessari varia molto a seconda del livello di confidenza che vogliamo ottenere e della prevalenza che sospettiamo. In generale, da un punto di vista pratico e semplice, si possono applicare i seguenti parametri per il nostro campionamento sierologico:
   
   Per i riproduttori:

• In allevamenti con meno di 25 animali: Si controlleranno tutti.

• In allevamenti con un numero di animali compresso fra 25 e 100 riproduttori: Si preleveranno 25 campioni che nelle successive determinazioni subiranno una rotazione.

• In allevamenti con più di 100 riproduttori: 30 campioni a rotazione.

Nell'ingrasso:

• Almeno 30 campioni per ciascuna zona dell'ingrasso.

L'altra domanda dovrebbe essere: di quale campione ho bisogno e come devo prelevarlo?. I sieroprofili si effettuano di solito a partire dal siero degli animali, anche se a volte ci può servire sapere la quantità di immunoglobuline presenti nel colostro e/o nel latte materno. I campioni di colostro vanno raccolti entro le 24 ore dopo il parto. Se si consegnano al laboratorio immediatamente conviene refrigerare ed inviarlo con refrigerante. Se la consegna avverrà nei giorni seguenti si deve congelare ed inviare poi in forma refrigerata. 

Il sangue, per ottenere il siero, si preleva di solito da:

Vena superficiale dell'orecchio. Mediante incisione e successiva raccolta in provetta o direttamente con una siringa dotata di ago di diametro 16-25 mm. Il vantaggio di questo metodo è la semplicità, però presenta come principale difficoltà la scarsa quantità di siero che si può ottenere e l'alta probabilità di contaminazione.

Vena caudale. Si utilizzano siringhe con aghi da 25 mm, vacutainer o amputazione parziale. E' un metodo relativamente semplice, limitato dal fatto che si producano all'incirca solo 0,5 ml. Per tanto non è ideale.

Vena giugulare. E' uno dei metodi più utilizzati soprattutto nelle scrofe. Si utilizzano siringhe "vacutainer" con aghi adeguati alle dimensioni dell'animale. Si possono estrarre da 10 a 30 ml.

Vena Cava. Si utilizza per prelevare il sangue da tutti i tipi di animali, dai suinetti agli adulti e soprattutto quando si ha bisogno di molto sangue. Gli aghi cambieranno a seconda del peso dell'animale (10 Kg. 25 mm, 45 Kg. 38 mm, 100 Kg. 50 mm, scrofe 100 mm.)

In fine, Cosa faccio con il sangue una volta prelevato?. Il sangue deve rimanere a temperatura ambiente (all'ombra e in una zona fresca) fino all'avvenuta coagulazione (più o meno una o due ore), e poi va tenuto in frigo a + 4º C tutta la notte. Per tempi più lunghi, è consigliabile centrifugare e almeno separare il siero dal coagulo prima dell'invio al laboratorio. Le provette devono essere chiaramente contrassegnate. Se lo studio che si vuole intraprendere implica la realizzazione di due determinazioni con un intervallo di 21 giorni (sieroconversione) sarebbe meglio congelare il siero una volta coagulato e separato dal coagulo ed aspettare il prelievo seguente per fare la stessa operazione e inviare entrambi i campioni insieme. Una buona diagnosi dipende in gran parte da un campione idoneo. Evitare contaminazioni o alterazioni del siero è sempre una garanzia per la diagnosi di laboratorio.

4. Quali differenze ci sono fra le varie tecniche?

Come abbiamo detto all'inizio di questo capitolo, esistono oggi diverse tecniche di laboratorio disponibili per realizzare uno studio sierologico. La capacità di diagnosi di un metodo, viene determinata dal calcolo della sensibilità e specificità di questo metodo, rispetto alla tecnica considerata di riferimento.Ci sono alcuni concetti che conviene ricordare per sapere valutare ognuna delle tecniche disponibili. Questi concetti sono: 

Sensibilità: E' la capacità di un metodo per rilevare sieri positivi rispetto ad una determinata malattia. La sensibilità permette di rilevare tutti i positivi.

Specificità: E' la capacità di un metodo per differenziare sieri positivi da sieri negativi in una determinata malattia. La specificità evita i falsi positivi. Nessun negativo deve essere considerato positivo dalla tecnica in uso.

Valore predittivo: E' la capacità di una tecnica di distinguere tra gli animali che stanno soffrendo una determinata malattia da quelli che non la stanno soffrendo. In definitiva, predire la sensibilità e specificità per un caso negativo e per un caso positivo. Il valore predittivo può essere:

Positivo: E' la frequenza della malattia tra gli animali risultati positivi.

Negativo: E' la frequenza dell'assenza della malattia negli animali risultati negativi.

Efficacia: Percentuale di animali classificati correttamente con un determinato metodo.

Positivo vero: Animale malato correttamente classificato dalla tecnica.

Positivo falso: Animale classificato in modo incorretto dalla tecnica utilizzata.

La convalida dei parametri di sensibilità, specificità e valore predittivo si realizza comparando i risultati di una tecnica di riferimento, o della malattia sicura con quelli ottenuti con la tecnica che dobbiamo avvalorare mediante la seguente formula:

A: Positivi per entrambe le tecniche.

B: Positivi sicuri che la tecnica oggetto di convalida da come negativi.

C: Positivi per la tecnica oggetto di convalida che sono sicuramente negativi.

D: Negativi per entrambe le tecniche.

Valore predittivo per i positivi:
A / A + C

Valore predittivo per i negativi:
C / B + D

Delle tecniche attualmente in uso, quelle che presentano maggiori livelli di sensibilità e specificità sono la sieroneutralizzazione e le tecniche ELISA, anche se se ne possono usare altre ed ottenere risultati simili. L'importante in questo senso, è ricordarsi che per paragonare risultati di evoluzione, stati diversi, ecc., conviene che si siano studiati i sieri sempre con la stessa tecnica e lo stesso laboratorio, altrimenti si potrebbero avere risultati diversi e si potrebbe confondere la diagnosi.