Actualmente existen diversas técnicas
para el diagnóstico de la infección por
PCV2. Sin embargo, es importante resaltar que la detección
del virus no es equivalente a la existencia de PMWS. Distintos
estudios epidemiológicos realizados en países
como Francia, UK y España, han demostrado que es
posible encontrar numerosas explotaciones con un alto
porcentaje de animales positivos a virus y/o anticuerpos
frente a PCV2 sin evidencia de signos clínicos
o lesiones. Por ello, la interpretación
de resultados laboratoriales debe ser evaluada cuidadosamente,
ya que ni la presencia de virus en sangre, ni la presencia
de anticuerpos específicos frente a circovirus
es indicativo de presencia de enfermedad. En todos
los casos un diagnóstico definitivo
sobre la presencia o no de enfermedad relacionada con
PCV2 debe incluir la detección del virus (antígenos
virales o su ácido nucleico) asociado con un cuadro
clínico y lesional.
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![](images/diagnostico.jpg)
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MUESTRAS
A REMITIR AL LABORATORIO
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Suero |
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Bazo |
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Tonsilas |
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Hígado |
-
Ganglios linfáticos |
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Riñón |
-
Pulmón |
-
Intestino |
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El diagnóstico
laboratorial de los circovirus porcinos se lleva a cabo
principalmente por aislamiento vírico
en células susceptibles, la detección del
virus empleando técnicas de detección de antígenos
virales (principalmente Inmunohistoquímica) o del
ácido nucleico viral (Hibridación
"in situ", y PCR)
y por la detección de anticuerpos específicos
(principalmente IPMA y ELISA). |
AISLAMIENTO DE CIRCOVIRUS
PORCINOS |
El aislamiento
de PCV1 y PCV2 se realiza por inoculación de macerados
de muestras sospechosas sobre cultivos primarios de macrófagos
y líneas célulares sensibles de riñón
de cerdo, pk15, asegurándose que éstas no
se encuentran persistentemente infectadas. Como los circovirus
no producen efecto citopático, la replicación
viral se observa mediante el empleo de técnicas
de detección viral, principalmente inmunohistoquímica
o PCR.
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![](images/pk15.jpg)
Cultivo celular de la línea PK 15
infectada con el circovirus porcino PCV1.
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DETECCIÓN
DEL VIRUS
Técnicas de detección viral
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Detección
antigénica
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Detección
del genoma viral
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- Inmunohistoquímica
- ELISA de captura |
- Hibridación "in situ"
- PCR |
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DETECCIÓN DE ANTÍGENOS
VIRALES |
![](images/fetgepp2-his.jpg)
Infección inicial en zona periportal,
con células mononucleares inflamatorias y hepatocitos
en situación periportal mostrando ácido
nucleico de PCV2. Hibridación in situ.
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Inmunohistoquímica (IHQ)
Permite la detección de antígenos
virales sobre improntas de tejido fijadas en acetona,
cortes de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina,
o cultivos celulares inoculados. Es una técnica
rápida, emplea 5 a 6 horas hasta la obtención
de resultados, y de sensibilidad muy elevada. La técnica
emplea un anticuerpo policlonal
o monoclonal específico frente a cada circovirus
en cuestión, que reacciona con los antígenos
virales de la muestra. La detección se realiza
mediante un anticuerpo
secundario conjugado con una enzima
o complejo enzimático.
Algunos estudios con determinados protocolos específicos
la evalúan con una sensibilidad comparable a la
hibridación "in situ" (HS).
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ELISA para la detección de antígenos
virales
Recientemente se ha desarrollado un ELISA
de captura que emplea anticuerpo monoclonal específico
de PCV2. Este ELISA detecta positivamente aislados
de PCV2 de distintos países, con resultados
de positividad comparables a los títulos de infectividad
de estos virus, en cultivos celulares de pk15.
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La sensibilidad de este método es
algo inferior a las técnica de IHQ o HS, y como
era de esperar, significativamente menor a la obtenida
empleando distintos métodos de PCR descritos, ya
que el ELISA requiere de la presencia de grandes cantidades
de antígenos virales en la muestra a analizar.
A pesar de esta desventaja, este
ELISA tiene capacidad para detectar todos los animales
experimentalmente inoculados con PCV2 que manifiestan
signos clínicos de enfermedad o lesiones histológicas,
donde existen grandes cantidades de virus en tejidos,
datos que se corroboran cuando se analizan muestras de
tejidos de animales enfermos con PMWS.
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Para la detección de PCV2 en cortes
histológicos de tejidos se utilizan dos técnicas:
la hibridación in situ (HIS)
y la inmunohistoquímica. La HIS detecta
ácido nucleico vírico, mediante una sonda
de DNA que híbrida de forma específica con
el ácido nucleico del virus presente en el tejido.
Esta técnica puede hacerse específica para
PCV2 o PCV1, eligiendo sondas de hibridación para
secuencias que son divergentes en ambos virus. La IHQ
detecta antígeno del virus mediante anticuerpos
mono o policlonales. Estas técnicas permiten identificar
ácido nucleico o proteínas de PCV en el
tejido. La presencia de PCV2 en tejidos, junto con lesiones
histológicas características, permite el
diagnóstico de PMWS.
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DETECCIÓN DEL
ÁCIDO NUCLEICO VIRAL |
Hibridación "in situ"
Permite la detección del genoma
viral directamente sobre los tejidos infectados. La técnica
se realiza de forma similar a la IHQ, utilizando sondas
DNA específicas que hibridan
con fragmentos de genoma presentes en muestras sospechosas
de contener PCV1 y/o PCV2, dependiendo de la sonda empleada.
La sonda normalmente lleva una molécula diana anclada,
que es posteriormente reconocida por un anticuerpo específico
conjugado con una enzima
o un complejo enzimático.
La sensibilidad de la técnica
es comparable e incluso puede ser superior a la técnica
de IHQ dependiendo de la sonda empleada.
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![](images/fetgep2-his.jpg)
Presencia de ácido nucleico de PCV2
en el núcleo de hepatocitos, y en algunas células,
también en citoplasma. Hibridación in situ.
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PCR (Protocolo de la técnica
de PCR individual y PCR múltiple)
Se han desarrollado distintas técnicas
de detección virológica por PCR
para circovirus porcinos. Entre ellos, destaca la PCR
múltiple, método que permite la detección
simultanea y caracterización de PCV1 y PCV2 en
una sola reacción de PCR. La reacción de
PCR en este caso emplea dos parejas de primers específicos
para PCV1 y PCV2, que amplifican productos específicos
de 180 y 300 pb. (Fig.1
y Fig.2)
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Fig.1
![](images/pcr_p.jpg)
Especificidad
de las PCR individuales de PCV1 y PCV2: Electroforesis
en gel de agarosa de los productos amplificados obtenidos
empleando DNA de distintos aislados de PCV1 , y PCV2
(aislados nº 1,2,3) y DNA de una línea celular
derivada de porcino, IBRS-2 (control negativo), como
molde en reacciones de PCR que contenían (a)
primers PCV-C/PCV-D que amplifican para PCV1; (b) primers
PCV-A/PCV-B que amplifican para PCV2. M: marcador de
peso molecular, Mw Marker VI, Boehringer manheim.
Pulse sobre la imagen para ampliar.
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Fig.2
![](images/pcr_p2.jpg)
Sensibilidad
de la PCR multiple para PCV1 y PCV2.
Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados
por PCR, obtenidos al ensayar diluciones seriadas de orden
10 del ADN de PCV-I PCV-II, o PCV1 y PCV2 conjuntamente,
en reacciones de PCR empleando las parejas de primers
conjuntamente : PCV-C/PCV-D (amplifica PCV1) y PCV-A/PCV-B
(amplifica PCV2), M: Mw Marker VI, Boehringer manheim.
Pulse sobre la imagen para ampliar.
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![](images/pcr_p3.jpg)
Especificidad
de la PCR Multiple para PCV1 y PCV2. Electroforesis
en gel de agarosa de los productos amplificados tras
el análisis de suspensiones virales conteniendo
material genético de los siguientes virus PCV-I,
PCV-II, PCV-I + PCV-II, PRRSv, PPA, PPC, BVD, FMD, Aujeszky,
y DNA de la línea celular IBRS-2 (control negativo).
La reacción solo amplifica específicamente
DNA de PCV1 y PCV2, y no el de otros virus porcinos
relacionados.
Pulse sobre la imagen para ampliar.
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Las técnicas de PCR son rápidas,
específicas y permiten realizar un diagnóstico
fiable de la presencia de PCV1 y/o PCV2 así como
llevar a cabo los estudios epidemiológicos a gran
escala, que están permitiendo conocer la incidencia
real de estos virus entre la población porcina,
y clarificar su importancia real como patógeno
concomitante. Su elevada sensibilidad
limita sin embargo su uso como herramienta diagnóstica
de patógenos endémicos, que como PCV2 con
frecuencia cursan de forma subclínica. Una
detección positiva de PCV2 por PCR en animales
enfermos, no significa necesariamente que la enfermedad
esté relacionada con PCV2. El desarrollo
de técnicas de PCR cuantitativas podría
en este caso aportar una mayor información diagnóstica.
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DETECCIÓN DE ANTICUERPOS
ESPECÍFICOS |
Se han desarrollado distintos test serológicos
para la detección específica de anticuerpos
frente a circovirus porcinos. Los utilizados son el IPMA
(inmunoperoxidase monolayer assay) y la Inmunofluorescencia
Indirecta. Más recientemente distintos laboratorios
acaban de desarrollar métodos basados en técnicas
de ELISA indirecto
y de competición.
Entre los primeros, uno emplea como antígeno una
proteína recombinante.
El ELISA de competición
utiliza un anticuerpo monoclonal competidor.
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Debido a su amplia difusión
entre la cabaña ganadera, la
seropositividad frente a PCV1,PCV2 o ámbos a la vez,
no se considera como una evidencia de infección activa,
o la existencia potencial de enfermedad, por lo que es
necesario realizar perfiles serológicos, tomando
muestras a diferentes tiempos para confirmar la presencia
de una infección activa en curso. |
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