Diagnóstico Clínico Diferencial

Actualmente existen diversas técnicas para el diagnóstico de la infección por PCV2. Sin embargo, es importante resaltar que la detección del virus no es equivalente a la existencia de PMWS. Distintos estudios epidemiológicos realizados en países como Francia, UK y España, han demostrado que es posible encontrar numerosas explotaciones con un alto porcentaje de animales positivos a virus y/o anticuerpos frente a PCV2 sin evidencia de signos clínicos o lesiones. Por ello, la interpretación de resultados laboratoriales debe ser evaluada cuidadosamente, ya que ni la presencia de virus en sangre, ni la presencia de anticuerpos específicos frente a circovirus es indicativo de presencia de enfermedad. En todos los casos un diagnóstico definitivo sobre la presencia o no de enfermedad relacionada con PCV2 debe incluir la detección del virus (antígenos virales o su ácido nucleico) asociado con un cuadro clínico y lesional.

ILUSTRANDO El PÁRRAFO QUE VIENE A CONTINUACIÓN DIAPOSITIVA POWER POINT "DIAGNÓSTICO PCV2"D

MUESTRAS A REMITIR AL LABORATORIO
- Suero	- Bazo
- Tonsilas	- Hígado
- Ganglios linfáticos	- Riñón
- Pulmón	- Intestino

El diagnóstico laboratorial de los circovirus porcinos se lleva a cabo principalmente por aislamiento vírico en células susceptibles, la detección del virus empleando técnicas de detección de antígenos virales (principalmente Inmunohistoquímica) o del ácido nucleico viral (Hibridación "in situ", y PCR) y por la detección de anticuerpos específicos (principalmente IPMA y ELISA).

AISLAMIENTO DE CIRCOVIRUS PORCINOS

El aislamiento de PCV1 y PCV2 se realiza por inoculación de macerados de muestras sospechosas sobre cultivos primarios de macrófagos y líneas célulares sensibles de riñón de cerdo, pk15, asegurándose que éstas no se encuentran persistentemente infectadas. Como los circovirus no producen efecto citopático, la replicación viral se observa mediante el empleo de técnicas de detección viral, principalmente inmunohistoquímica o PCR.

FOTO DE INOCULACIÓN A CULTIVO

DETECCIÓN DEL VIRUS Técnicas de detección viral
Detección antigénica	Detección del genoma viral
- Inmunohistoquímica - ELISA de captura	- Hibridación "in situ" - PCR

DETECCIÓN DE ANTÍGENOS VIRALES

FOTO IHQ DE BARCELONA

Inmunohistoquímica (IHQ)

Permite la detección de antígenos virales sobre improntas de tejido fijadas en acetona, cortes de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, o cultivos celulares inoculados. Es una técnica rápida, emplea 5 a 6 horas hasta la obtención de resultados, y de sensibilidad muy elevada. La técnica emplea un anticuerpo policlonal o monoclonal específico frente a cada circovirus en cuestión, que reacciona con los antígenos virales de la muestra. La detección se realiza mediante un anticuerpo secundario conjugado con una enzima o complejo enzimático. Algunos estudios con determinados protocolos específicos la evalúan con una sensibilidad comparable a la hibridación "in situ" (HS).

ELISA para la detección de antígenos virales

Recientemente se ha desarrollado un ELISA de captura que emplea anticuerpo monoclonal específico de PCV2. Este ELISA detecta positivamente aislados de PCV2 de distintos países, con resultados de positividad comparables a los títulos de infectividad de estos virus, en cultivos celulares de pk15.

La sensibilidad de este método es algo inferior a las técnica de IHQ o HS, y como era de esperar, significativamente menor a la obtenida empleando distintos métodos de PCR descritos, ya que el ELISA requiere de la presencia de grandes cantidades de antígenos virales en la muestra a analizar. A pesar de esta desventaja, este ELISA tiene capacidad para detectar todos los animales experimentalmente inoculados con PCV2 que manifiestan signos clínicos de enfermedad o lesiones histológicas, donde existen grandes cantidades de virus en tejidos, datos que se corroboran cuando se analizan muestras de tejidos de animales enfermos con PMWS.

Para la detección de PCV2 en cortes histológicos de tejidos se utilizan dos técnicas: la hibridación in situ (HIS) y la inmunohistoquímica. La HIS detecta ácido nucleico vírico, mediante una sonda de DNA que híbrida de forma específica con el ácido nucleico del virus presente en el tejido. Esta técnica puede hacerse específica para PCV2 o PCV1, eligiendo sondas de hibridación para secuencias que son divergentes en ambos virus. La IHQ detecta antígeno del virus mediante anticuerpos mono o policlonales. Estas técnicas permiten identificar ácido nucleico o proteínas de PCV en el tejido. La presencia de PCV2 en tejidos, junto con lesiones histológicas características, permite el diagnóstico de PMWS.

DETECCIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO VIRAL

Hibridación "in situ"

Permite la detección del genoma viral directamente sobre los tejidos infectados. La técnica se realiza de forma similar a la IHQ, utilizando sondas DNA específicas que hibridan con fragmentos de genoma presentes en muestras sospechosas de contener PCV1 y/o PCV2, dependiendo de la sonda empleada. La sonda normalmente lleva una molécula diana anclada, que es posteriormente reconocida por un anticuerpo específico conjugado con una enzima o un complejo enzimático.
La sensibilidad de la técnica es comparable e incluso puede ser superior a la técnica de IHQ dependiendo de la sonda empleada.

FOTOS HIBRIDACIÓN IN SITU (BARCELONA)

PCR (Protocolo de la técnica de PCR individual y PCR múltiple)

Se han desarrollado distintas técnicas de detección virológica por PCR para circovirus porcinos. Entre ellos, destaca la PCR múltiple, método que permite la detección simultanea y caracterización de PCV1 y PCV2 en una sola reacción de PCR. La reacción de PCR en este caso emplea dos parejas de primers específicos para PCV1 y PCV2, que amplifican productos específicos de 180 y 300 pb.

FOTOS: PCR3 ILUSTRANDO EL PÁRRAFO ANTERIOR

Las técnicas de PCR son rápidas, específicas y permiten realizar un diagnóstico fiable de la presencia de PCV1 y/o PCV2 así como llevar a cabo los estudios epidemiológicos a gran escala, que están permitiendo conocer la incidencia real de estos virus entre la población porcina, y clarificar su importancia real como patógeno concomitante. Su elevada sensibilidad limita sin embargo su uso como herramienta diagnóstica de patógenos endémicos, que como PCV2 con frecuencia cursan de forma subclínica. Una detección positiva de PCV2 por PCR en animales enfermos, no significa necesariamente que la enfermedad esté relacionada con PCV2. El desarrollo de técnicas de PCR cuantitativas podría en este caso aportar una mayor información diagnóstica.

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS

Se han desarrollado distintos test serológicos para la detección específica de anticuerpos frente a circovirus porcinos. Los utilizados son el IPMA (inmunoperoxidase monolayer assay) y la Inmunofluorescencia Indirecta. Más recientemente distintos laboratorios acaban de desarrollar métodos basados en técnicas de ELISA indirecto y de competición. Entre los primeros, uno emplea como antígeno una proteína recombinante. El ELISA de competición utiliza un anticuerpo monoclonal competidor.

ILUSTRANDO El PÁRRAFO ANTERIOR DIAPOSITIVA POWER POINT "anticuerpos PCV"

Debido a su amplia difusión entre la cabaña ganadera, la seropositividad frente a PCV1,PCV2 o ámbos a la vez, no se considera como una evidencia de infección activa, o la existencia potencial de enfermedad, por lo que es necesario realizar perfiles serológicos, tomando muestras a diferentes tiempos para confirmar la presencia de una infección activa en curso.