Enfermedad de Glässer - Diagnóstico de Laboratorio

Aunque la historia clínica, los datos epidemiológicos y los antecedentes pueden resultar muy orientativos en el diagnóstico de la enfermedad de Glässer, solo el laboratorio es conclusivo.

El aislamiento es una cuestión capital, como en otros microorganismos del grupo, aunque no siempre sea una empresa fácil, a lo que se suma el hecho de que otros microorganismos de más fácil supervivencia y multiplicación en las mismas muestras clínicas, pueden 'ocultar' o 'enmascarar' la presencia de H. parasuis. Los mejores resultados se obtienen cultivando fluidos, exudados o líquidos procedentes de varios tipos de membranas serosas, incluyendo líquido cefalorraquídeo y sangre, procedente del corazón, aunque no se observen lesiones sospechosas. Del mismo modo puede utilizarse, también, líquido ascítico, de la cavidad torácica, líquido pericárdico o articular, hisopos nasales o traqueales o parénquima pulmonar. Proporcionan buen resultado hisopos o escobillones impregnados en el material clínico descrito. El tiempo transcurrido entre la toma de muestras y las inoculaciones en medios de cultivo, para el aislamiento, posee gran importancia. Si se prevé más allá de 24 horas de demora, es muy conveniente la utilización de hisopos con medio de transporte, que mejoran sustancialmente la supervivencia del agente y facilitan la recuperación.

Figura 7. Los hisopos o escobillones son muy útiles en el diagnóstico. Permiten la toma de muestras, su envío y la utilización directa para la siembra en los medios de cultivo.

En el laboratorio, para el aislamiento, se recomienda un medio base para agar sangre, enriquecido con triptosa, con un 5% de sangre de caballo desfibrinada. Se utiliza una estría nodriza de St. aureus o St. epidermidis sobre la que se inocula el material de prueba. Como se ha señalado en otro lugar, se puede utilizar también agar chocolate u otras opciones como el agar PPLO o el agar de Levinthal o el de Gilbride y Rosendal (agar tripticasa-soja), enriquecidos mediante la adición de 0'025% de NAD, suero de caballo, extracto de levadura y glucosa. Cualquier fórmula puede hacerse selectiva mediante la incorporación de lincomicina o bacitracina Las condiciones de cultivo incluyen un periodo de incubación de 24-48 horas a 37ºC y 5% de CO².

Solo el aislamiento proporciona seguridad en el diagnóstico, a lo que se suma el hecho de que un mismo animal puede estar infectado, simultáneamente, por varios serotipos diferentes, por lo que la recuperación a partir de distintos órganos adquiere una importancia particular.

La diferenciación con otros microorganismos próximos puede llevarse a cabo mediante procedimientos de cultivo convencionales e incluso mediante la utilización de procedimientos rápidos en microceldillas complementados con la información procente de los medios con sangre (hemólisis y CAMP). A este respecto, es conveniente la diferenciación de A. minor, A. indolicus, A. porcinus y Haemophilus taxón C que, no siendo patógenos, comparten los mismos lugares de aislamiento primario.

En lo posible, el aislamiento debe ir seguido de la tipificación serológica mediante la técnica de inmunodifusión en gel, normalizada, utilizando una preparación calentada del antígeno. Debe recordarse, al respecto, que la prueba disponible dista mucho de ser un procedimiento óptimo de clasificación, a la vista del gran porcentaje de cepas no tipables descritos por cualquiera de los autores que han referido resultados de tipificación en todos los países.

En algunos lugares se practica un método de fijación del complemento para la tifipicación, pero plantea el grave inconveniente de numerosas reacciones cruzadas entre serotipos, lo que unido a la posibilidad de que en la misma explotación y aún en el mismo animal circulen distintos serotipos, representa un procedimiento muy complicado de usar y extraer conclusiones prácticas útiles.

La detección directa del antígeno puede intentarse mediante métodos inmunohistoquímicos, por ejemplo un sistema avidina-biotina, como se ha demostrado en el caso del serotipo 5, en condiciones experimentales, aunque los resultados dependerán estrictamente de la calidad de los anticuerpos utilizados (policlonales o monoclonales). Tiene la ventaja de que pueden aplicarse a tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, pero no resuelve reacciones falsamente positivas con A. pleuropneumoniae.

La detección mediante procedimientos moleculares posee un gran futuro. A este respecto, nuestro grupo (Rodríguez Ferri et al.) ha puesto a punto una PCR (reacción en cadena, de la polimerasa) con primers diseñados sobre zonas de homología, conservadas, de las secuencias de los genes tbpB y tbpA, capaces no solo de detectar la presencia de H. parasuis entre colonias sospechosas en cultivo, sino incluso directamente de material patológico obtenido del cadáver o hisopos de secreción nasal.

Figura 8a: tbpA-PCR. A. pleuropneumoniae, H. parasuis y A.suis.

Figura 8b: tbpA-PCR en H. parasuis, serotipos 1 a 15 (Rodríguez Ferri et al.)

El procedimiento discrimina, en función del tamaño de banda detectada, la presencia de A. pleuropneumoniae y A. suis. Otros microorganismos porcinos no patógenos del mismo género o próximos (A. indolicus, A. porcinus, A. minor, Haemophilus taxón C), de la misma familia (P. multocida) o de otras, resultan claramente diferenciados. El procedimiento puede completarse mediante un análisis por restricción con endonucleasas (PCR-RFLP), utilizando por ejemplo AvaI, TaqI y RsaI, que permite diferenciar tipos genéticos en número importante.

Figura 9. tbpB-PCR en A. pleuropneumoniae, A. suis y H. parasuis (Rodríguez Ferri et al.)

Figura 10. PCR-RFLP de tbpA de H. parasuis (Rodríguez Ferri et al.)

La detección de anticuerpos en el suero de los animales enfermos no posee demasiado sentido. Por un lado, no permite diferenciar el serotipo implicado en la infección y por otro, el porcentaje previsto de animales portadores de los mismos ha de ser, necesariamente muy alto y su significación muy escasa, dado el carácter de comensal habitual en las fosas nasales de animales sanos. A esto se le suman, además, que en muchas explotaciones circulan, sin demasiadas consecuencias, cepas de H. parasuis de virulencia baja o nula, pero que sí inducen respuesta humoral detectable y que, por otra parte, algunas cepas de H. parasuis solo son débilmente inmunogénicas, lo que traduce dificultades para la detección de la respuesta e incluso tampoco permite disponer de reactivos de calidad para ello. Las razones anteriores hacen que, una serología positiva sea absolutamente compatible con un animal sano, hecho que, por otra parte, es considerado conveniente desde el punto de vista del control, puesto que supone una cierta experiencia inmunológica que previene de procesos agudos que pueden causar desastres económicos en la explotación. Todavía, a los inconvenientes anteriores hay que unir la falta de especificidad que traduce no solo las reacciones cruzadas entre serotipos, ya comentadas, sino también con otras especies, como es el caso de A. pleuropneumoniae y de otras especies de la familia. En la práctica, se han utilizado diversas opciones serológicas de diagnóstico, como la reacción de fijación del complemento, el ELISA o la inmunofluorescencia.

El ELISA indirecto es, en la actualidad, el procedimiento más utilizado, con un antígeno obtenido a partir de un serotipo virulento, con niveles aceptables de sensibilidad y especificidad, aunque también se presentan reacciones cruzadas entre serotipos.