La Enfermedad de Aujeszky - Diagnóstico de Laboratorio

Arias, M., Sierra, M.A. y Sánchez-Vizcaíno, J.M.

Existen un gran número de metodologías específicas para el diagnóstico de la enfermedad de Aujeszky. Este diagnóstico está basado, como en la mayoría de las enfermedades viricas, en el aislamiento e identificación del virus, mediante la detección de antígenos o del ácido nucleico viral, o en la determinación de la presencia de anticuerpos específicos en suero o fluidos orgánicos.

MUESTRAS A REMITIR AL LABORATORIO

· SANGRE CON ANTICOAGULANTE (EDTA)
· SANGRE SIN ANTICOAGULANTE (SUERO)
· AMIGDALAS
· CEREBRO

· GANGLIO TRIGÉMINO
· MÉDULA ESPINAL
· PULMÓN
· BAZO

AISLAMIENTO DEL VIRUS

La técnica de aislamiento viral (AV), está considerada como el método de mayor sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de la Enfermedad de Aujeszky. La infección de células susceptibles por ADV provoca un efecto citopático en la célula infectada. Para la identificación del virus, generalmente se aplican sobre los cultivos celulares infectados, técnicas de detección de antígenos o ADN viral, con el fin de diferenciar este efecto citopático del originado por otros virus o factores tóxicos inespecíficos.

Cultivo de células susceptibles infectados con ADV.

DETECCIÓN DE ANTÍGENOS VIRALES

Técnicas más utilizadas para la detección de antígenos virales de ADV

Inmunofluorescencia Directa (IFD)
Inmunohistoquímica directa e indirecta
Técnica de IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay)

Inmunofluorescencia Directa		Inmunohistoquímica
Se realiza a partir de cortes o improntas de tejidos de animales sospechosos. La muestra de elección son las amígdalas, aunque también pueden emplearse muestras de cerebro o improntas faríngeas. Esta técnica tiene la ventaja de ofrecer el resultado en una hora y los resultados en el caso de muestras procedentes de lechones recién nacidos con síntomas clínicos son comparables a los obtenidos por aislamiento vírico. Cuando las muestras proceden de animales adultos la sensibilidad de la IFD en muy inferior al AV, por lo que si el historial clínico y datos epidemiológicos sugieren la presencia de ADV, un resultado negativo de IFD en animales adultos debe confirmarse siempre mediante AV.		Las técnicas de Inmunohistoquímica en sus modalidades directa o indirecta permiten la detección de antígenos virales en las fases agudas de infección. Se aplican de forma similar a la IFD generalmente sobre tejidos previamente fijados e incluidos en parafina, siendo el revelado realizado con un complejo de peroxidasa-anti-peroxidasa, o de avidina-peroxidasa. El proceso, sin embargo es algo más complicado y requiere más tiempo. Su ventaja radica en que permite localizar y distinguir las lesiones propias producidas por ADV, de aquellas producidas por otros patógenos secundarios.

IPMA
Esta técnica, basada en un ensayo de inoculación de células susceptibles con el material sospechoso e inmunoreacción con un suero especifico anti-ADV, permite la detección específica del virus sobre los cultivos infectados. Es muy sensible y permite obtener un resultado en dos días.

DETECCIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO VIRAL

Técnica de PCR

Es una técnica de sensibilidad muy elevada, que detecta cantidades mínimas del agente infeccioso en cualquier tipo de muestra y tejidos del animal en tan solo unas horas, estadíos muy tempranos, o incluso cuando la infección esta ya establecida, en presencia de elevados niveles de anticuerpos neutralizantes. La PCR ofrece también la posibilidad de analizar muestras donde el virus ya no se encuentre viable o sea difícil realizar su aislamiento, como el semen.

El empleo de la PCR para la detección del ADV ofrece además importantes ventajas, ya que permite detectar el virus en estado latente, donde no se expresan antígenos virales, pòr lo que la PCR es la única vía para poner de manifiesto la presencia del virus latente en el animal.

Esquema de la técnica de PCR. Proceso de amplificación exponencial hasta el 4º ciclo.

El uso de "primers" específicos de una región del gen que codifica para la glicoproteína gE, permite conocer si un animal vacunado ha sido o no infectado. El fragmento amplificado puede ser posteriormente analizado por otras técnicas, como el análisis de restricción o la secuenciación, que proporcionan más información sobre la caracterización de la cepa y confirman el diagnóstico.

Hoy en día un gran número de laboratorios poseen esta tecnología, y es recomendable que al menos ésta se encuentre en los Laboratorios de referencia de cada país.

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

Las técnicas serológicas son las más utilizadas para poner de manifiesto la presencia del ADV en una explotación, y constituyen la base del diagnóstico laboratorial de rutina en las campañas de control y erradicación.

La serología permite realizar estudios sobre la prevalencia del virus en las explotaciones y sobre la dinámica de circulación del virus campo, pudiendo evaluar los métodos de manejo mas idóneos para conseguir minimizar la difusión del virus. Los estudios serológicos son también de gran utilidad para el control de las reposiciones, la adecuación y el seguimiento de los programas vacunales y la evaluación de la capacidad inmunológica de las poblaciones vacunadas.
Existen un gran número de metodologías para la detección de anticuerpos específicos frente a ADV. En la actualidad las técnicas más utilizadas para la detección de anticuerpos de ADV son la Virusneutralización , la Aglutinación en látex y el ELISA

Técnicas serológicas más utilizadas en el diagnóstico de la Enfermedad de Aujeszky.

En los países que actualmente están llevando a cabo programas de vacunación-erradicación con vacunas marcadas, solamente es posible aplicar la técnica de ELISA diferencial, única metodología capaz de discriminar entre una respuesta de anticuerpos producidos por vacunación o por infección.

Virusneutralización

Esquema de la técnica de virusneutralización para la detección de anticuerpos frente a ADV.

La técnica de virusneutralización (VN) es muy sensible y se utiliza fundamentalmente para la confirmación de casos positivos. Se basa en la detección de anticuerpos neutralizantes en el suero de los animales sospechosos, que son producidos frente a las glicoproteínas gB, gC y gD, presentes tanto en todas las cepas del virus campo y en las cepas vacunales , incluyendo las vacunas de subunidades. Mediante la VN se detectan animales positivos a partir del 8-10 días post-infección (dpi). Está considerada como la técnica de referencia para la detección de anticuerpos de ADV.

Es una técnica muy útil para la confirmación de casos positivos en áreas no sometidas a programas vacunales. Sin embargo no es posible utilizarla cuando se emplean programas vacunales, incluso con las nuevas vacunas marcadas, ya que esta técnica detecta anticuerpos neutralizantes que son producidos tanto por el virus de campo como por todos los inmunógenos incluidos en cualquier tipo de vacunas.

Test de Aglutinación en látex

Detecta anticuerpos específicos frente al virus, por aglutinación de partículas de látex recubiertas de glicoproteínas del virus. Es la técnica más sencilla y rápida, que permite en tan sólo 10 minutos obtener un resultado.

ELISA

Es sin duda la técnica serológica más utilizada por su alta sensibilidad y especificidad y la posibilidad de realizar en pocas horas estudios sobre grandes poblaciones de manera rápida, sencilla y económica.
Se han desarrollado diferentes métodos de ELISA, de tipo indirecto, de bloqueo o competición. En general, todos se correlacionan bien con el test de Virusneutralización, siendo incluso algo más sensible que este último, ya que permiten detectar un mayor espectro de anticuerpos, que incluye los anticuerpos no neutralizantes, y sueros débilmente positivos. En el caso de lechones, la interpretación de resultados puede complicarse debido a la presencia de anticuerpos maternales en el suero.

Cuando se aplican programas de vacunación con vacunas gE-,es necesario utilizar técnicas de ELISA diferencial para detectar los animales infectados. Hoy en dia, los test utilizados están basados en técnicas de competición, que detectan la presencia de anticuerpos anti-gE en suero, ya que son las vacunas gE- las que se han impuesto en el mercado mundial. Algunos test comerciales ofrecen la posibilidad de analizar la respuesta serológica frente a otra proteína muy inmunogénica y esencial del virus, la glicoproteína gB, presente tanto en el virus de campo como en las vacunas marcadas vivas e inactivadas gE- actuales, lo que permite conocer cual es el estado inmunológico de los animales vacunados.

Técnica serológica de Elisa diferencial de anticuerpos vacunales ó de infección, cuando se emplean vacunas gE-.

En determinadas ocasiones, la interpretación de los resultados obtenidos en estos test diferenciales puede presentar algunos problemas, debido a la aparición de resultados falsos positivos (baja especificidad) o falsos negativos (baja sensibilidad), cuyas causas pueden ser muy diversas. La gran mayoría de estos problemas se detectan fácilmente si se han utilizado los controles positivos y negativos que se adjuntan en los kits comerciales.

Problemas más importantes que pueden presentarse en la interpretación de resultados

I) en cerdos multivacunados se puede observar un aumento de reacciones falso positivas;

II) el impedimento estérico producido por anticuerpos dirigidos frente a otras glicoproteínas presentes en un determinado kit comercial pueden impedir la reacción específica del anticuerpo competidor marcado;

III) la presencia de factores inespecíficos que impiden la unión de los anticuerpos específicos,

IV) la posibilidad de un lote de un kit o una parte de él (o incluso una placa o parte de ella) que pueda ser defectuoso, por un mal tapizado de las placas,

V) reactivos y diluyentes en malas condiciones,

VI) la caducidad de los reactivos, o incluso un mal manejo de los propios reactivos que componen el kit, ya sea en el envío o en el punto de destino;

VII) las excesivas congelaciones y descongelaciones de reactivos extremadamente sensibles,

VIII) conjugados mal titulados,

IX) lavados deficientes de las placas durante la prueba,

X) tiempos excesivamente cortos de incubación,

XI) la utilización de algún reactivo de un lote en otro lote distinto del mismo kit,

XII) diluciones incorrectas de los reactivos,

XIII) la utilización de reactivos ajenos al kit, etc.

Todo ello puede generar resultados poco fiables e incorrectos, provocando una pérdida real de especificidad y sensibilidad de la técnica.

PERFILES SEROLÓGICOS

La realización de muestreos serológicos seriados (seroperfiles) aporta información de gran utilidad sobre la situación de una explotación y están especialmente recomendados antes de seleccionar un programa de vacunación, para elegir el más adecuado. También ofrecen información sobre la evolución y eficacia del mismo.

Los perfiles serológicos representan un importante medio para aumentar el control sanitario y reducir las perdidas ocasionadas por un estado sanitario deficiente. Los seroperfiles están siendo utilizados dentro de este contexto para prevenir la entrada de enfermedades, para la elección del momento más adecuado de la primovacunación de lechones, y para evaluar el potencial de respuesta inmune protectora de las poblaciones vacunadas ante una eventual exposición del virus de campo.