Protocolo para la RT-PCR en un solo paso
Imprimir Imprimir
EXTRACCION DE ARN CON TRIPURE REAGENT
- 1 ml/tubo del reactivo TRIPURE
- 0.1 ml/tubo de muestra. Mezclar bien con ayuda del vortex. Incubar 5 minutos T. ambiente. Centrifugar unos segundos , un pulso de centrífuga, para eliminar restos de muestra de la tapa.
- Añadir 0.2 ml/tubo de cloroformo. Agitar vortex 15''. Incubar 10' T. amb. Agitando varias veces.
- Centrifugar a 4ºC 10.000 rpm 15'.
- Recoger la fase superior, con cuidado de no arrastrar interfase y pasarla a otro tubo.
- Añadir 0.5 ml de isopropanol y mezclar bien por inversión. Incubar 10' T. amb.
- Centrifugar a 4ºC a 13.000 rpm. 10'.
- Retirar el sobrenadante con cuidado de no arrastrar el pellet.
- Lavar el pellet con 500µl de etanol 75% frío. Agitar ligeramente, invertir los tubos para lavar las paredes.
- Centrifugar a 4ºC a 13.000 rpm. 5'. (Poniendo los tubos en la misma orientación que en la centrifugación anterior).
- Retirar el sobrenadante con cuidado de no arrastrar el pellet pero tratando de eliminar todo el etanol.
- Secar a T. amb. (unos 10') hasta que no queden restos de etanol.
- Resuspender en 10µl de H2O estéril, agitar en vortex evitando dejar gotas por las paredes.
- Guardar a -20ºC hasta su uso ( o a 4ºC si se va a emplear en 1-2 h desde su obtención).
CONTROLES DE EXTRACCIÓN: En todas las extracciones de RNA se incluyen siempre tres controles que nos dan la fiabilidad necesaria para dar o no por buena una extracción:
  • Un control positivo y un control límite, correspondientes a las dos últimas diluciones positivas por RT-PCR de una suspensión del virus PRRS de título conocido, con lo que comprobamos el rendimiento de la extracción.
  • Un control negativo, realizando la extracción a partir de H2O y con el que aseguramos que no ha habido contaminación en la extracción.
    • PRRS: RT-PCR EN UN PASO

    RT-PCR MIX
    REACTIVOS
    VOLUMEN (reacción 25 µl)
    CONCENTRACION FINAL
    Buffer 10X Taq Gold
    2,5 µl
    1X
    Cl2Mg 25 mM
    2,5 µl
    2,5 mM
    dNTPs 10 mM
    0,75 µl
    0,3 mM
    Inhibidor de RNasa 20U/µl
    0,5 µl
    0,4 U/µl
    MuMLV (Rtasa) 50 U/µl
    0,125 µl
    0,25 U/µl
    Taq Gold 5 U/µl
    0,125 µl
    0,025 U/µl
    Primer PRRS-1 5µM
    2 µl
    0,4 µM
    Primer PRRS-2 5µM
    2 µl
    0,4 µM
    H2O
    9,5 µl
    USAR 5 µl de MUESTRA (RNA) + 20 µl de RT-PCR MIX
    PROGRAMA DE AMPLIFICACION
    48ºC
    30'
    		 (Transcripción reversa)
    95ºC
    10'
    		 (Inactivación Rtasa, activación TaqGold)
    95ºC
    60ºC
    }
    15''
    40 ciclos
    2'
    		(Amplificación del DNA)
    72ºC
    7'
    		( Paso extra de elongación)
    SECUENCIA DE LOS PRIMERS
    PRRS 1 (P 5')
    5'
    		 
    3'
    C
    C
    A
    G
    C
    C
    A
    G
    T
    C
    A
    A
    T
    C
    A
    R
    C
    T
    G
    T
    G
    R= A/G
    PRRS 1 (P 5')
    5'
    		 
    3'
    G
    C
    G
    A
    A
    T
    C
    A
    G
    G
    C
    G
    C
    A
    C
    W
    G
    T
    A
    T
    G
    W= A/T
    Tamaño del fragmento amplificado 291 pb. Primers descritos en Donadeu et al. Swine Health and Production.V. 7(6) 255-261.
    CONTROLES DE REACCIÓN

    Al preparar la mezcla de reacción para la amplificación del ácido nucleico extraído siempre incluimos dos controles que proporcionan la fiabilidad necesaria a la reacción:

  • Control positivo (Límite) de reacción, para confirmar el rendimiento de la reacción.

  • Control negativo de reacción: corresponde a la mezcla de reacción a la que hemos añadido H2O, en lugar de un RNA. Así nos aseguramos de que no ha habido contaminación en la preparación de la mezcla de reacción.
    • ANALISIS ELECTROFORETICO

    1.- En un matraz de 200 ml se pesan 2 gramos de agarosa.

    2.- Añadir 100 ml de tampón TAE 1X .

    3.- Calentar en el microondas hasta que la agarosa esté bien disuelta.

    4.- Añadir bromuro de etidio hasta concentración final 0,5 µg/ml. Agitar para que se reparta homogéneamente.

    5.- Preparar la bandeja sellando los extremos con cinta adhesiva y colocar los peines. Verter la agarosa disuelta sobre la bandeja. Esperar que gelifique (unos 20 minutos).

    6.- Retirar la cinta de los extremos. Poner la bandeja en la cubeta y añadir tampón TAE 1X conteniendo BrEt 0,5 µg/ml hasta que cubra el gel. Quitar los peines con cuidado

    7.- Preparar las muestras añadiéndolas 3?l de tampón de carga 10 X.Cargar 10??l de cada muestra en los pocillos del gel. Poner marcador de peso molecular en un pocillo.

    8.- Conectar a la fuente de alimentación (las muestras migran hacia el polo positivo). Aplicar 150-200 voltios y dejar correr el gel aproximadamente 40 minutos.

    9.- Colocar el gel sobre un transiluminador de luz UV para visualizar las bandas de DNA.
    TAE 50 X:
    - Tris 242 g
    - Acético glacial 57,1
    - EDTA 0,5 M pH 8 100 mL
    - Agua hasta 1000 mL
    Tampón de carga 10 X:
    - Glicerol 30%
    - Azul de bromofenol 0.2%
    - Xilencianol 0.2%

    Imprimir Imprimir