1.- La sangre es extraída por punción de la vena cava anterior de cerdos donantes con un peso vivo de 40 a 100 kilos, usando el aparato de transfusión que la conduce directamente a un desfibrinador mecánico, donde es agitada durante 15-30 minutos. La cantidad de sangre que se puede extraer es de 20 ml por kilo de peso vivo.

2.- La sangre desfibrinada se transvasa por medio del mismo aparato de transfusión desde el desfibrinador a las botellas de centrífuga de 500 ml.

3.- Se centrifuga a 2.500 r.p.m. durante 20 minutos.

4.- El suero sobrenadante es trasvasado a un matraz de 500ml.

5.- Se recoge con pipeta la capa superficial del sedimento que contiene los leucocitos, evitando coger un exceso de hematíes.

6.- Recoger aparte un volumen de hematíes, diluidos con PBS 1/10, para la posterior reacción de la hemoadsorción. Un factor importante para la especificidad del test es el uso del suero del mismo cerdo del que se han obtenido los leucocitos. Así como los hematíes necesarios para la reacción. Esto evita las reacciones inespecíficas de aglutinación al mezclar leucocitos y suero procedentes de diferentes animales.

7.- Una vez obtenidos los leucocitos, se depositan en un tubo de centrifuga y se añade tres veces el volumen de leucocitos obtenidos de cloruro amónico 0,83%.

8.- Pasados 15 minutos, se añade el mismo volumen de PBS y se centrifuga a 2.000 r.p.m. durante 15 minutos.

9.- Se retira el sobrenadante y se lava de nuevo el pellet con PBS.

10.- Retirar el sobrenadante y recoger el sedimento celular en 5-10 ml de suero de cerdo obtenido en el punto 4.

11.- Se realiza un recuento de leucocitos, colocando el volumen total a una concentración de 8-10 x 10₆ leucocitos por ml de suero.

12.- Finalmente, se reparte el cultivo obtenido en la placa Microtiter a 200 ml por pocillo y se incuba a 37ºC.

1.- Preparar un macerado de bazo, pulmón u otro órgano de un animal sospechoso en PBS. Añadir aproximadamente 1g de órgano por cada 10 ml de PBS.

2.- Centrifugar la suspensión a 2.000 r.p.m. durante 15 minutos.

3.- Recoger el sobrenadante y añadir antibióticos, a razón de 4.000 U.I. de penicilina y 3mg de estreptomicina por ml. Dejar 1 hora a temperatura ambiente para que actúen los antibióticos. Una alternativa es filtrar el macerado por un filtro de 45 micras de diámetro.

4.- Inocular los leucocitos con 20ml de macerado filtrado o estéril, como mínimo cuatro pocillos de la placa por muestra.

5.- Dejar otros 4 pocillos sin inocular como controles de la evolución del cultivo. Poner controles, tanto positivos como negativos para comprobar que realmente ha funcionado la técnica y poder comparar las muestras problemas.

6.- Incubar a 37ºC con CO₂.

A partir del líquido sobrenadante de los pocillos inoculados que muestran efecto citopático de los cultivos se subinoculan nuevos cultivo de leucocitos (2º pase). El enriquecimiento del virus permite ver la HAD. Cuando en este segundo pase los cultivos experimentan también efecto citopático sin HAD se repite el tercer pase por leucocitos. Entonces puede aparecer la HAD o continuar el efecto citopático sin HAD en pases sucesivos, en el caso de cepas no hemoadsorbentes.

Para mayor seguridad, en todas las muestras negativas en el primer pase, se realiza de forma sistemática la subinoculación en cultivos de leucocitos, antes de formular el dictamen negativo.