Para los métodos bacteriológicos se utilizan muestras clínicas que incluyen, generalmente, material de las lesiones pulmonares o de las tonsilas y siempre es preferible el trabajo con material fresco. Si la distancia desde la explotación al laboratorio es corta y se dispone de material conveniente para el traslado (neveras portátiles, convenientemente aisladas), lo mejor es incluir los pulmones enteros y las tonsilas. Una vez en el laboratorio se realiza la toma desde diversos lugares del pulmón, preferentemente de zonas con lesiones bien delimitadas, incluso encapsuladas, mejor de la periferia que del centro. Para simplificar el procedimiento pueden recogerse varias muestras mediante impregnación de escobillones o hisopos en el parénquima pulmonar al que se accede durante la necropsia después de cauterizar con una espátula al rojo la superficie del órgano. En cualquier caso, es conveniente la utilización de medios de transporte, como el medio de Stuart o de Amies, que prolongan la supervivencia del microorganismo lo que, si la distancia al laboratorio exige varias horas de viaje, es prácticamente una necesidad.

El aislamiento a partir de animales con enfermedad aguda, por lo general, no plantea problemas importantes. En el caso de los portadores crónicos, sin embargo, la presencia de un número bajo de bacterias en el tracto respiratorio y su mezcla con la flora natural (presente en gran cantidad) dificulta enormemente su recuperación hasta el punto de que son habituales fracasos en animales comprobados enfermos por otros procedimientos. Recientemente se ha puesto a punto una técnica de separación inmunomagnética, para el aislamiento del serotipo 2, utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales fijados a barritas inmunomagnéticas, que incrementa las posibilidades de éxito.

La caracterización ha de definirse suficientemente mediante reacciones bioquímicas y otras, resultando de especial utilidad la presencia de potentes actividades ureasa, b-galactosidasa y fosfatasa alcalina, así como su capacidad hemolítica, que se puede exaltar sobre agar sangre de bovino u ovino por la acción sinérgica de la b-toxina de una cepa de S. aureus (efecto CAMP). Las principales actividades bioquímicas de A. pleuropneumoniae quedan reflejadas en las Tablas 1 y 2, en las que se recogen algunas características diferenciales con otras especies próximas.

El tipado bioquímico es una alternativa a otros métodos de diferenciación y, en primera instancia, sirve de base para la descripción de los biotipos I y II. Es evidente, sin embargo, que estos métodos difícilmente mejoran a los inmunológicos, pero pueden ser útiles para cepas que presenten dificultades en el serotipado.

Se han descrito un sinfín de reacciones cruzadas, que dificultan una buena conclusión del serotipo, aunque son especialmente importantes las debidas al carácter inmunodominante del LPS y que hacen reaccionar a los serotipos 1, 9 y 11, el 4 con el 7 y, finalmente, el 3, 6 y 8; otras reacciones se deben a la contaminación del reactivo diagnóstico con antígenos de origen citoplasmático, debido a una manipulación o procesado inadecuados. Como norma general, cuanto más intenso sea el tratamiento bacteriano, mayor es la inespecificidad de los antígenos recogidos (los antígenos específicos son los más superficiales y se desprenden con tratamientos ligeros).

Fijación del complemento. Originalmente fue concebida como un método de detección de especie transformándose después en una prueba de detección específica del serotipo. Los antígenos se preparan por sonicación de una suspensión de bacterias, recogiendo el sobrenadante. Además, se requiere la presencia de complemento, suero bovino fetal, y el suero problema. La fijación del complemento es más específica que la hemaglutinación indirecta, porque es capaz de distinguir entre A. pleuropneumoniae y H. parasuis pero su validez para el serotipado es cuestionada ya que la frecuencia de falsos negativos es alta. La realización de esta prueba es, por otro lado, un proceso laborioso y complejo, que requiere un elevado grado de estandarización para su éxito y con inconvenientes técnicos que lo complican.

Otra opción alternativa es un sistema de competición para la detección del anticuerpo que se ha empleado con éxito para la detección del serotipo 8 y del 2, aunque el problema con estos ELISAs es que no detectan todas las cepas.
Recientemente se han descrito diversos métodos con especificidad de especie, dirigidos a las proteínas Apx; el procedimiento más conocido utiliza la proteína recombinante ApxII, pero tiene el inconveniente de que esta toxina no está presente en las cepas de los serotipos 3 y 10. Una alternativa posible es la detección simultánea y múltiple de las tres toxinas Apx, en cuyo caso sí se pueden detectar cepas de cualquier serotipo pero no discriminar entre ellos, además de que investigaciones recientes han demostrado la presencia de análogos de las toxinas Apx en diversas especies bacterianas de interés veterinario, lo que se traduce en reacciones cruzadas con ellas, inhabilitándolas como antígeno diagnóstico.

Aglutinación y coaglutinación. Son métodos simples, rápidos (aglutinación y coaglutinación) o lentos (aglutinación), para la identificación y serotipado de cepas de A. pleuropneumoniae. Existen tres variantes útiles de la aglutinación: la reacción lenta en tubo, la aglutinación en tubo con 2-mercaptoetanol (2-ME), y la rápida en porta. Con el antisuero se practican diluciones seriadas, que se mezclan con el antígeno a partes iguales y el resultado de la aglutinación se determina por inspección visual. A diferencia de otros sistemas, la aglutinación rápida evita muchas reacciones cruzadas, aunque posee el inconveniente de que no permite la clasificación de serotipos rugosos, que son autoaglutinantes, especialmente el 3 y 6 y, en ocasiones, 1 y 5, inconveniente que se salva mediante la coaglutinación que tampoco es completamente válido, porque no diferencia el serotipo 3 de los serotipos 6 y 8.

Pese a no tener la misma sensibilidad que la hemaglutinación indirecta, la coaglutinación es, en la actualidad, el método rápido de elección para serotipar cepas, aunque para una clasificación precisa y definitiva aún se recurre a aquella. Se han descrito otras variantes, como la aglutinación con partículas de látex, de uso poco extendido. La inmunofluorescencia indirecta, la inmunodifusión en gel o la precipitación en anillo, representan otras opciones, pero sus inconvenientes superan a las ventajas y su uso, por ello, tampoco se ha extendido.

Además, se han descrito técnicas inmunohistoquímicas basadas, por lo general, en la utilización de antisueros específicos de serotipo, que se revelan con sueros secundarios marcados con peroxidasa, pudiendo amplificarse la reacción mediante un tercer suero antiperoxidasa marcado con peroxidasa. También pueden emplearse sueros primarios marcados con biotina, en cuyo caso se revela la reacción con los complejos avidina-peroxidasa o estreptavidina-biotina-peroxidasa. Son técnicas rápidas, fáciles de ejecutar y que permiten el empleo de muestras fijadas antiguas.

La PCR es un método eficaz para la detección y el tipado de A. pleuropneumoniae, y se plantea como una alternativa a los métodos inmunológicos. Se utilizó por primera vez en 1991 con primers inespecíficos.

Finalmente, en base a la secuencia del gen aroA, también se ha desarrollado un sistema PCR-RFLP que permite la separación de los doce serotipos del biotipo I en tres grupos, aunque se presentan reacciones cruzadas con A. equuli. El sistema, sin embargo, solo se aplicó en las cepas de referencia y en condiciones de laboratorio. En nuestro laboratorio, hemos puesto a punto un sistema PCR y PCR-RFLP para la detección y tipado de A. pleuropneumoniae basado en las secuencias de los genes tbpA y tbpB. Se obtuvieron primers a partir de las regiones conservadas en los alineamiento, seleccionándo 2 parejas de primers para uno y otro. Para los análisis RFLP, los productos de amplificación PCR del tbpA fueron digeridos con distintas enzimas de restricción.

Los dos primers para el gen tbpA permitieron la obtención de un fragmento de 2'7 kb en cada uno de los doce serotipos de A. pleuropneumoniae, así como en A. suis, sin diferencias cuantitativas ni cualitativas entre las bandas. No se obtuvieron productos de amplificación PCR en el resto de las especies de Actinobacillus estudiadas ni en ninguna de las otras especies próximas incluidas en el estudio, con excepción de H. parasuis, en el que se obtuvo una banda de 1'9 kb. La sensibilidad de la detección fue estimada entre 5-50 UFC, en el caso de la cepa CM5 del serotipo 1. En el caso de los primers para el gen tbpB, se obtuvieron bandas de 1'8 kb en los serotipos 1, 6, 8 y 12 (de A. pleuropneumoniae) y A. suis, mientras que se obtuvieron bandas ligeramente más pequeñas (1'7 kb) en el caso de los serotipos 2,3,4,7,9,10 y 11 de A. pleuropneumoniae y en las cepas de H. parasuis. No se obtuvieron amplificaciones en el caso del serotipo 5 de A. pleuropneumoniae ni del resto de especies relacionadas. El limite de detección mínima en el caso de estos primers se estableció entre 3x10² y 3x10³ UFC en la cepa CM5.

Análisis de la 5' nucleasa TaqMan: Aunque la PCR consigue un alto grado de especificidad y sensibilidad, no se trata de un procedimiento que se adapte fácilmente al procesado de un gran número de muestras, además de que en su desarrollo son precisas precauciones rigurosas para evitar contaminaciones cruzadas y otros inconvenientes (aparición de bandas débiles, en ocasiones difíciles de interpretar, etc.). En A. pleuropneumoniae se ha puesto a punto, recientemente, un método 5' nucleasa TaqMan basado en el gen omlA, que se fundamenta en la detección a tiempo real de sondas fluorogénicas internas en tubos de PCR cerrados. Los primers y la sonda se diseñaron a partir de un fragmento del gen, común a todos los serotipos que proporcionó un amplicón de 92 pb. La prueba obtuvo una sensibilidad y especificidad del 100% comparada con otras (incluyendo el cultivo), así como un alto nivel de reproducibilidad.

La fijación del complemento fue adaptada a la pleuroneumonía en 1971. Los antígenos más utilizados vienen representados por un extracto capsular (a 56°C durante 30 minutos) o por la fase acuosa de una extracción fenol-agua. Ha sido sustituida progresivamente por el ELISA, en razón de los importantes inconvenientes relacionados con algunas características de los sueros porcinos que precisan su calentamiento a 56°C durante 30 minutos para destruir el complemento propio, lo que provoca la destrucción de un factor imprescindible que hace necesario el aporte de suero sin calentar de otra especie como fuente externa del factor inactivado, además de que algunos sueros presentan actividad anticomplementaria, lo que obliga a la incorporación de controles adecuados y a la presencia de un porcentaje elevado de reacciones falsas negativas. A pesar de sus numerosos inconvenientes, la técnica aún sigue citándose.

Desde 1981, el método ELISA ha sido empleado progresivamente como procedimiento de elección, utilizando diferentes tipos antigénicos como los extraídos con Tween-20, con dodecil sulfato sódico, con fenol-agua, con EDTA y purificado por cromatografía en columna en "Sephacryl S-200", obtenidos por sonicación y, finalmente, mediante el tratamiento a 120ºC. Los resultados más específicos se han conseguido con el antígeno extraído con EDTA. Otros autores han recurrido a antígenos obtenidos mediante precipitación de un sobrenadante de cultivo de 18 horas con Cetavlon, seguido de una extracción con ClNa, precipitación con etanol y nueva una extracción fenol-agua. Finalmente se ha utilizado también un extracto salino de los serotipos 1 y 5, hervido, extraído por fenol-agua, del que utilizaban la fase acuosa.

La ApxI del serotipo 5 también ha sido empleada como antígeno e incluso las tres Apx (I, II y III) han sido evaluadas, aunque sus interrelaciones dificultan la especificidad. Asimismo se ha desarrollado un ELISA inhibición con anticuerpos monoclonales, para la detección de anticuerpos frente al serotipo 2, con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98%.
En Dinamarca se ha empleado un extracto salino (básicamente LPS de cadena larga) calentado a 100°C durante una hora o directamente LPS purificado, en un ELISA bloqueo con un antisuero policlonal frente al serotipo 2. En Canadá también se ha recurrido de forma rutinaria a este antígeno hervido, en un sistema. Recientemente, ha sido descrito un método ELISA, específico de serotipo, basado en el empleo del polisacárido capsular marcado con el sistema biotina/estreptavidina