PROTOCOLO DE ELISA SANDWICH INDIRECTO

Principio

Se trata de un ELISA sandwich indirecto para la detección de antígenos virales de Fiebre Aftosa (FA) e identificar el serotipo correspondiente. Los pocillos de la placa de ELISA se encuentran tapizados con un antisuero de conejo frente al virus de la Fiebre Aftosa (VFA) (en el caso de Europa se recomienda emplear actualmente al menos los serotipos O-TUR, A-22-Irak y C1-Noville), que es el llamado suero de captura. Se añaden las suspensiones de las muestras que vamos a analizar a cada pocillo de la placa, junto con los controles positivo, negativo y blanco. Después de su incubación se procede al lavado de la placa y se añade un antisuero de cobaya homólogo al serotipo empleado en el paso anterior en el suero captura (suero detector). Tras su incubación se lava nuevamente la placa y se añade un anti-IgG de cobaya conjugado con peroxidasa. Después de una nueva incubación la placa se vuelve a lavar y se añade la solución substrato. Si la muestra es positiva el antígeno se unirá a los sueros captura y detector, desarrollándose una reacción coloreada. En caso de que la muestra fuese negativa no se producirá color.

Reactivos Suministrados con el Kit de ELISA

- Anticuerpos de Captura:
- Suero de conejo frente al VFA (serotipos A, O, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 o ASIA).
- Mantener a -20°C.

- Anticuerpo Detector:
- Suero de cobaya frente al VFA (serotipos A, O, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 o ASIA).
- Mantener a -20°C.

- Control de referencia positivo:
- Serotipos A, O, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 o ASIA.
- Mantener a -70°C.

- Control Negativo:
- Suspensión de cultivo celular IBRS-2.
- Mantener a -20°C.

El resto de los reactivos no se encuentran suministrados en el kit, pero pueden ser fácilmente adquiridos en diferentes laboratorios.

Materiales

- Placas de 96 pocillos
- Micropipetas de 20 µl, 200 µl y 1000 µl
- Puntas desechables de micropipetas
- Lavador automático o botella de lavado
- Pipetas de 5 ml y 10 ml
- Sellador de placas
- Agua de MilliQ
- Incubador
- Muestras
- Espectrofotómetro (lector de ELISA)
- Tubos y botellas

Preparación de los Reactivos:

Tampones de ELISA:

Tampón de tapizado Carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6:

Na₂CO₃...............................
NaCO₃H...............................
Agua destilada hasta ............

1,59 g
2,93 g
1000 ml

Solución de Lavado (SL):

Agua destilada+ 0.05% de Tween 20.

Solución de Bloqueo (SB):

a) PBS:
NaCl	8,00 g
KCl	0,20 g
Na₂HPO₄ 12 H₂O	2,90 g
KH₂PO₄	0,20 g
Agua destilada hasta	1000 ml
Ajustar el pH a 7.4 con NaOH. Mantener a temperatura ambiente.

b) SB-1:
Añadir a 1000 ml de PBS los siguientes reactivos:
Tween 20	0,05%
Leche desnatada en polvo	2%

c) SB-2:
Añadir a 1000 ml de PBS los siguientes reactivos:
Tween 20	0,05%
Leche desnatada en polvo	2%
Suero fetal bovino libre de anticuerpos frente a VFA	10%
Suero de conejo libre de anticuerpos frente a VFA.	2%

Substrato:

Solución de substrato DMAB/MBTH
DMAB-Ácido-3-dimetilaminobenzoico (SIGMA nº D-1643)
MBTH-3 Metil-2-benzothiazolinone hidracine hidrocloride monohidrate (SIGMA Nº M-8006).
Conservar el DMAB a temperatura ambiente y el MBTH a 4ºC. Ambos son sensibles a la luz.

Tampón Fosfato 0,1M, pH 7
PO₄H₂K	5,3 g
PO₄HNa₂	8,65 g
Agua destilada	1000 ml

Preparación del substrato para 100 placas:
Solución DMAB 80.6 mM
Disolver 13,315 g. del ácido DMAB en 900 ml de tampón fosfato 0,1M pH 7. Agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, ajustando periódicamente el pH a 7 con NaOH 10M. A continuación, ajustar el volumen final a 1 litro y filtrar a través de un embudo con papel de filtro.
Solución MBTH 1.56 mM
Disolver 0,3646 g del ácido MBTH en 900 ml de tampón fosfato 0,1M pH 7. Agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, ajustando periódicamente el pH a 6,25 con HCl concentrado. Seguidamente ajustar el volumen final a 1 litro y filtrar a través de un embudo con papel de filtro.
Alicuotar las soluciones por separado, en volúmenes adecuados, según el número de placas que se procesen. Las alícuotas se congelan a -20°C hasta su uso. Cuando se necesiten, se sacan las alícuotas horas antes de su utilización.

Solución de substrato DMB/MBTH por placa:
10 ml DMAB + 10 ml MBTH + 5 µl H₂O₂ 30%

Esta mezcla debe realizarse en el momento de su utilización, justo antes de revelar la placa.

Solución de Bloqueo de la Reacción

Ácido sulfúrico 3N
Ácido sulfúrico	16.1 ml
Agua destilada hasta	200 ml

Preparación de Muestras:

La muestra de elección es el epitelio de las vesículas o el fluido de su interior. En condiciones ideales se tomará 1 g de tejido epitelial de una vesícula intacta o recientemente rota. Estas muestras se deberán incluir en un medio de transporte compuesto a partes iguales por glicerol y tampón fosfato 0,04 M, pH 7,2-7,4, preferiblemente con adición de antibióticos. En caso de que no dispongamos de dicho medio de transporte se podría emplear también medio de cultivo celular o PBS en su lugar, pero es importante que el pH final se encuentre dentro de un rango de pH entre 7,2 y 7,6.

Cuando estas muestras vesiculares no se encuentren disponibles se pueden emplear también como muestras fluido esofaríngeo tomado mediante probang-cups en ganado bovino, o hisopos faríngeos en cerdos, incluidos en 2 ml de medio de transporte (tampón fosfato 0,08 M conteniendo 0,01% de albúmina bovina sérica, 0,002% de rojo fenol, antibióticos y pH ajustado a 7,2).

Método:

- Tapizar placas para ELISA (Nunc-Maxysorp) con 50 ml por pocillo con las Ig de captura diluidas en tampón carbonato/bicarbonato (TC), pH 9.6, en la dilución indicada
- Sellar las placas e incubar durante la noche a 4°C. Conservar a -20°C con el tampón para futuro uso. Descongelar, incubar 1 hora a 37º C y lavar 4 veces con agua destilada con 0,05% de Tween 20.
- Añadir 50 µl de las suspensiones de las muestras y controles positivo y negativo. Dos pocillos se mantendrán con 50 µl de SB-1.
- Sellar la placa con un plástico adhesivo e incubar durante 1 hora a 37°C en agitación orbital.
- Lavar 4 veces con la SL.
- Agregar a cada pocillo 50 ml del detector previamente bloqueado durante 30 minutos en SB-2 en la dilución de uso indicada.
- Incubar 1 hora a 37º C en agitación orbital.
- Lavar 4 veces con SL.
- Añadir 50 ml de conjugado(anti-IgG de cobaya conjugado con peroxidasa previamente bloqueado durante 30 minutos en SB-2 en la dilución de uso indicada.
- Incubar 30 min a 37°C en agitación orbital.
- Lavar 4 veces con SL.
- Agregar 200 ml de substrato (DMAB-MBTH) a cada pocillo y mantener a temperatura ambiente.
- Detener la reacción con 50 ml de Ácido sulfúrico 3N cuando inicia la aparición de color de fondo.
- Leer la placa en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 600-620 nm.

Interpretación:

La presencia de VFA en la muestras originará una reacción positiva en la placa con desarrollo de color en el pocillo. El serotipo del virus detectado también podrá determinarse empleándose sueros de captura y detector frente a los diferentes serotipos.

Aquellas muestras que resulten cerca del valor del punto de corte se deberán confirmar mediante nuevo análisis por ELISA, PCR y aislamiento en cultivo celular.