| Se trata de un ELISA sandwich
de bloqueo en fase líquida para la detección
de anticuerpos específicos frente a virus de Fiebre
Aftosa (FA) e identificar el serotipo correspondiente. Los
pocillos de la placa de ELISA se encuentran tapizados con
un antisuero de conejo frente al virus de la Fiebre Aftosa
(VFA) (en el caso de Europa se recomienda emplear actualmente
al menos los serotipos O-TUR, A-22-Irak y C1-Noville), que
es el llamado suero de captura y constituye la Fase
Sólida (FS). ). Los sueros problema, después
de incubados con antígeno (Ag) conocido e inactivado
en una placa auxiliar (Fase Líquida-FL), se depositan
sobre la FS, junto con los controles positivo, negativo
y blanco. Después de su incubación se procede
al lavado de la FS y se añade un antisuero de cobaya
homólogo al serotipo empleado en el paso anterior
en el suero captura (suero detector). Tras su incubación
se lava nuevamente la placa y se añade un anti-IgG
de cobaya conjugado con peroxidasa. Después de una
nueva incubación la placa se vuelve a lavar y se
añade la solución substrato. Si la muestra
es negativa el antígeno de la FL permanecerá
libre, con lo que se podrá unir a los sueros captura
y detector, desarrollándose una reacción coloreada.
En caso de que la muestra fuese positiva el antígeno
se bloqueará por los anticuerpos de la muestra, con
lo que no se podrá unir a los sueros captura y detector,
no produciéndose color. |
| Reactivos Suministrados
con el Kit de ELISA |
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- Anticuerpos de Captura:
- Suero de conejo frente
al VFA (serotipos A, O, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 o ASIA).
- Mantener a -20°C.
- Anticuerpo Detector:
- Suero de cobaya frente
al VFA (serotipos A, O, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 o ASIA).
- Mantener a -20°C.
- Antígeno:
- Obtenido mediante replicación
del VFA del serotipo correspondiente en cultivos celulares
e inactivado con BEI.
- Mantener a -70°C.
- Control de referencia positivo:
- Suero positivo frente al
serotipo correspondiente del VFA (A, O, C, SAT-1, SAT-2,
SAT-3 o ASIA).
- Mantener a -20°C.
- Control Negativo:
- Suero negativo frente al
VFA.
- Mantener a -20°C.
El resto de los reactivos no se encuentran suministrados
en el kit, pero pueden ser fácilmente adquiridos
en diferentes laboratorios.
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- Placas de 96 pocillos
- Micropipetas de 20 µl, 200 µl y 1000 µl
- Puntas desechables de micropipetas
- Lavador automático o botella de lavado
- Pipetas de 5 ml y 10 ml
- Sellador de placas
- Agua de MilliQ
- Incubador
- Muestras
- Espectrofotómetro (lector de ELISA)
- Tubos y botellas
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| Preparación de
los Reactivos: |
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Tampones de ELISA:
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| Tampón de tapizado
Carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH |
Na2CO3...............................
NaCO3H...............................
Agua destilada hasta ............ |
1,59 g
2,93 g
1000 ml |
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| Solución de
Lavado (SL): |
| Agua
destilada+ 0.05% de Tween 20. |
| Solución de
Bloqueo (SB): |
a) PBS:
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| NaCl |
8,00 g |
| KCl |
0,20 g |
| Na2HPO4 12 H2O |
2,90 g |
| KH2PO4 |
0,20 g |
| Agua destilada
hasta |
1000 ml |
| Ajustar
el pH a 7.4 con NaOH. Mantener a temperatura ambiente. |
b)
SB-1:
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| Añadir
a 1000 ml de PBS los siguientes reactivos: |
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Tween 20
|
0,05% |
| Leche
desnatada en polvo |
2% |
c) SB-2:
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| Añadir
a 1000 ml de PBS los siguientes reactivos: |
| Tween 20 |
0,05% |
| Leche desnatada
en polvo |
2% |
| Suero fetal bovino
libre de anticuerpos frente a VFA |
10% |
| Suero de conejo
libre de anticuerpos frente a VFA. |
2% |
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| Substrato: |
| Solución
de substrato DMAB/MBTH |
| DMAB-Ácido-3-dimetilaminobenzoico
(SIGMA nº D-1643) |
| MBTH-3
Metil-2-benzothiazolinone hidracine hidrocloride monohidrate
(SIGMA Nº M-8006). |
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Conservar el DMAB a temperatura ambiente y el MBTH
a 4ºC. Ambos son sensibles a la luz. |
| Tampón
Fosfato 0,1M, pH 7 |
| PO4H2K |
5,3 g |
| PO4HNa2 |
8,65 g |
| Agua destilada
|
1000 ml |
| Preparación
del substrato para 100 placas: |
| Solución
DMAB 80.6 mM |
| Disolver
13,315 g. del ácido DMAB en 900 ml de
tampón fosfato 0,1M pH 7. Agitar durante 1
hora a temperatura ambiente, ajustando periódicamente
el pH a 7 con NaOH 10M. A continuación, ajustar
el volumen final a 1 litro y filtrar a través
de un embudo con papel de filtro. |
| Solución
MBTH 1.56 mM |
| Disolver
0,3646 g del ácido MBTH en 900 ml de
tampón fosfato 0,1M pH 7. Agitar durante 1
hora a temperatura ambiente, ajustando periódicamente
el pH a 6,25 con HCl concentrado. Seguidamente ajustar
el volumen final a 1 litro y filtrar a través
de un embudo con papel de filtro. |
| Alicuotar
las soluciones por separado, en volúmenes adecuados,
según el número de placas que se procesen.
Las alícuotas se congelan a -20°C hasta
su uso. Cuando se necesiten, se sacan las alícuotas
horas antes de su utilización. |
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Solución
de substrato DMB/MBTH por placa:
10 ml DMAB + 10 ml MBTH + 5 ml H2O2 30%
|
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Esta mezcla
debe realizarse en el momento de su utilización,
justo antes de revelar la placa.
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| Solución de
Bloqueo de la Reacción |
| Ácido
sulfúrico 3N |
| Ácido sulfúrico |
16.1
ml |
| Agua destilada
hasta |
200 ml |
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1.-
Tapizado de placas (FS):
- Usar placas Maxisorp
- Diluir el suero de conejo anti-FMD en tampón
carbonato/bicarbonato pH 9,6
- Añadir 50 µl/pocillo
- Incubar toda la noche a Tª ambiente
- Para usar en el momento lavarlas 4-5 veces, y si no,
guardar a -20º-70ºC.
2.-
Fase líquida (FL):
- En placa de fondo en U hacer diluciones; 3 µl
sueros + 27 µl SB-1. Si el ELISA se hace para los
tres serotipos se ponen 10 µl de los sueros + 90
µl SB-1; y transferir 30 µl a tres placas
(una para cada uno de los serotipos).
- Añadir 30 µl de la dilución apropiada
de virus (En SB-1)
- Incubar toda la noche a 4ºC o 1h a 37ºC.
3.-
Añadir 50 µl de la FL a las placas tapizadas
con el suero de conejo e incubar 1 hora a 37ºC, en
agitación.
4.-
Lavar 4-5 veces
5.-
Detector: Suero cobaya anti-VFA (bloquear 30 min. antes):
- Hacer diluciones según título en SB-2
- Añadir 50 µl/pocillo
- Incubar 1h a 37ºC.
6.-
Lavar 4-5 veces
7.-
Conjugado anti-cobaya-HRPO (bloquear 30 min. antes):
- Hacer diluciones en SB-2
- Poner 50 µl/pocillo
- Incubar 30 minutos a 37ºC.
8.-
Lavar 5 veces
9.-
Substrato DMAB-MBTH:
10 ml de DMAB + 10 ml MBTH + 5 µl H2O, 20 ml cantidad
suficiente para una placa.
- Añadir 200 µl/pocillo
- Dejar que tome color, aproximadamente 10 minutos (se
toma como referencia el blanco, si empieza a subir color
frenar antes)
- Frenar con 50 µl/pocillo de sulfúrico 3N
10.-
Leer a 620 nm
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| Interpretación
de los Resultados: |
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Calcular el 50% de la media de la Densidad Óptica
(DO) de los valores del antígeno. Los sueros problema
que proporcionan una DO igual o mayor al 50% de la obtenida
en el control de antígeno son negativos. Aquellos
que tienen una DO menor al 50% de la alcanzada en el control
de antígeno se consideran como positivos y deberá
confirmarse el resultado mediante virusneutralización.
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Blanco: 50 µl/pocillo de SB-1
Control antígeno: SB-1 + antígeno.
Control sueros referencia: Con sueros control positivos
y negativos (sueros referencia). Se utilizan a la misma
dilución que los sueros problema.
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